凝胶色谱柱操作 1. 肿胀
市售凝胶为干颗粒，一般为40~63um。凝胶在使用前需要在洗脱液中充分溶胀一到几天。如果将湿凝胶在沸水浴中逐渐加热至接近沸腾，溶胀时间可缩短至1～2小时。凝胶溶胀必须*，否则会造成色谱柱不均匀。热溶胀法还可以杀死凝胶中产生的细菌，去除凝胶中的气泡。
2、装柱
由于凝胶的分离取决于筛分效果，因此对凝胶的填充要求非常高。整个填充柱必须非常均匀，否则必须重新填充。凝胶上柱前，可通过水浮去除凝胶中的单体、粉末和杂质，并通过真空泵排出凝胶中的气泡。最好在商品中购买玻璃或有机玻璃凝胶空柱。塔的两端有平筛或筛板。将色谱柱垂直固定，加入少量流动相以消除柱底气泡，并加入一些流动相至色谱柱高度的1/4左右。柱顶接漏斗，颈径约为柱颈的一半，然后在搅拌下缓慢、均匀、连续地加入脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，保持适当的流量率，凝胶颗粒会逐层水平上升，并均匀地沉积在柱子中，直到达到所需的高度。取出漏斗后，用较小的滤纸轻轻盖住凝胶床表面，然后用大量洗脱液冲洗凝胶床一段时间。
3. 色谱柱均匀性检查
凝胶色谱的分离效果主要取决于色谱柱是否装填均匀。在分离样品之前，必须检查色谱柱的均匀性。由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可以是将荧光灯与色谱柱平行放置，用肉眼观察色谱柱内是否有“条纹"或气泡。也可以将有色大分子添加到色谱柱中。添加物质的分子量应在凝胶柱的分离范围内。如果在色谱柱中观察到窄、均匀、平坦的条带，则说明色谱柱性能良好；如果出现色带 当凝胶柱规则、凌乱且很宽时，必须重新装填。
4. 加载样本
安装凝胶柱后，柱子必须与流动相充分平衡，然后才能上样。凝胶柱的负载也是一个非常重要的因素。一般原则是使样品柱塞尽可能窄而平。为防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前对样品进行过滤或离心。样品溶液的浓度应尽可能高较大，但如果样品的溶解度与温度有关，则样品必须适当稀释，样品温度应与色谱柱温度一致。一切准备就绪后，您可以打开色谱柱的活塞，使流动相刚好与凝胶床平行并关闭出口。用滴管吸取溶液样品，沿柱壁轻轻加入色谱柱，打开流出口，使样品溶液渗入凝胶床。当样品液面正好与凝胶床表面齐平时，再次加入少量洗脱液冲洗管壁。重复上述操作如此，每次关键不仅要使样品准确地渗入凝胶床，而且不要使凝胶床表面干燥和开裂。然后您可以逐渐增加洗脱液的量以进行洗脱。整个过程必须小心，以免损坏凝胶柱床。
5. 冲洗
凝胶色谱的流动相有一半以上使用水或缓冲溶液，少数使用水和一些极性有机溶剂的混合溶液。此外，还有一些特殊的流动相系统。根据溶液分子的性质确定。加入样品后，可将色谱床与淋洗液储存瓶和收集器连接，设定合适的流速，即可对淋洗液进行定量分配和收集。然后根据溶质分子的性质，选择光学、化学或陶粒过滤方法进行定性和定量测定。
6. 再生
因为原则上凝胶层析中凝胶和溶质分子之间没有相互作用，所以在用流动相稍微平衡后可以进行下一步的层析操作。然而，在实际应用中，某些污染物经常会污染凝胶。对于沉积在凝胶床表面的不溶物，可以调整表面凝胶，适当加入一些新的溶胀凝胶，进行再平衡过程；如果整个柱子有轻微污染，可用0.5mol NaCl溶液洗脱。一般情况下，一个凝胶柱可以使用半年。
如果凝胶柱多次使用，其颜色发生变化，流速降低，表面有污渍等，则必须对凝胶进行再生。凝胶的再生是指采用适当的方法去除凝胶中的污染物，恢复其原有性能。将交联葡萄糖凝胶厂用温热的0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L氯化钠及其混合物浸泡，用水冲洗至中性；而对于聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，由于酸碱不稳定，所以通常将其浸泡在盐溶液中，然后用水洗至中性。
7. 保存
经常使用的凝胶主要是在潮湿状态下储存的。为避免凝胶床被细菌污染，可加入少许氯仿和苯酚或硝基苯等化学品，可使色谱柱站立数月至一年。凝胶的干燥，应先对凝胶进行浮选，去除细小颗粒，并用大量水洗以去除盐分和污染物，然后逐渐增加浓度一弹簧使凝胶收缩，并在60℃下干燥。 -80 度，在整个操作过程中。房间内的蒸馏水、用具和房间必须干净。琼脂糖凝胶的干燥操作比较麻烦，干燥后不易溶解膨胀，所以一般仍以湿润状态保存。
PW系列凝胶色谱柱填料为亲水性刚性多孔球形聚合物，具有优良的化学和机械性能。适用于凝胶色谱模式碳硫分析仪对蛋白质、多肽、多糖、寡糖、DNA、RNA、水溶性有机聚合物等水溶性高分子样品的分离。 PW系列色谱柱适用的pH范围为2-12。可使用含50%的混合有机溶剂作为流动相，操作温度可达80℃（TSK-gel G-DNA-PW为50℃）。虽然大部分 PW 填料呈弱负性（约 5~8μ eq/mL），但它们对碳硫分析仪对非离子、阴离子和大多数阳离子样品的分离没有影响。由于与 SW 色谱柱相比，PW 填料具有非常宽的分离范围、更线性的校准曲线和低得多的吸附特性，因此 PW 色谱柱常用于分离水溶性合成聚合物。
相对而言，SW色谱柱适用于碳硫分析仪分离单分散陶粒滤料大分子，如蛋白质等，而PW色谱柱更适用于多分散样品，如多糖、合成聚合物等。分开了。
|
